間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細(xì)胞, 在體內(nèi)具有分布廣泛, 體外能夠大量擴(kuò)增和免疫原性低等特點(diǎn), 是一種細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。自20世紀(jì)60年代，F(xiàn)riedenstein等發(fā)現(xiàn)在人骨髓長期培養(yǎng)中, 存在一種形態(tài)類似成纖維細(xì)胞的貼壁生長的細(xì)胞且移植到小鼠體內(nèi)具有成骨能力和造血支持作用, 將這種細(xì)胞命名為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀(jì)90年代末, 人們才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細(xì)胞, 稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。

      隨后研究者也從其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝臟、骨實(shí)質(zhì)和肌肉等中成功分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。作為一類成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩種模式動(dòng)物上, 其他動(dòng)物的間充質(zhì)干細(xì)胞報(bào)道相對(duì)較少。選取中國*家禽品種鴨子為實(shí)驗(yàn)材料, 以鴨胚胎肝臟中的間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象, 對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定, 進(jìn)行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 為家禽干細(xì)胞研究及畜禽遺傳資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染8-12h，連續(xù)傳13代，采用高濃度含嘌呤霉素培養(yǎng)基（4μg/mL）培養(yǎng)，篩選陽性克隆；篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞。

鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1)準(zhǔn)備鴨胚胎肝臟間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基（dmem 高糖和F12培養(yǎng)基1：1搭配，10%血清 ，1%雙抗以及1％自己配置的間質(zhì)細(xì)胞因子。）。

2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3)凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至6ml。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2ml*培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。