泰澤隱孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)規(guī)則：

1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。

3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。

4、實(shí)驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。

6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì)自然流下去。

8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。

9、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

10、對(duì)結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。

?為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)人員需嚴(yán)格遵守以下補(bǔ)充操作規(guī)范：

11. 反應(yīng)板密封時(shí)需使用光學(xué)級(jí)封板膜，避免PCR反應(yīng)過程中蒸發(fā)導(dǎo)致體系濃度變化。封膜前應(yīng)檢查孔邊緣有無液體殘留，防止交叉污染。

12. 擴(kuò)增程序設(shè)置時(shí)需進(jìn)行溫度校準(zhǔn)，建議使用第三方溫度驗(yàn)證儀對(duì)PCR儀各孔位進(jìn)行梯度檢測(cè)，溫差應(yīng)控制在±0.3℃范圍內(nèi)。

13. 熒光信號(hào)采集階段應(yīng)關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室光源，避免環(huán)境光干擾。建議在反應(yīng)板上方加裝遮光罩，特別是使用多通道檢測(cè)時(shí)。

14. 每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)置NTC（無模板對(duì)照）和陽性對(duì)照。NTC出現(xiàn)擴(kuò)增曲線時(shí)，需排查氣溶膠污染可能性，建議使用含UDG酶的防污染體系。

15. 數(shù)據(jù)分析時(shí)采用儀器配套軟件進(jìn)行基線自動(dòng)校正，手動(dòng)調(diào)整范圍應(yīng)控制在3-15個(gè)循環(huán)之間。對(duì)于非典型擴(kuò)增曲線（如鋸齒狀、平臺(tái)期不穩(wěn)），需用原始數(shù)據(jù)復(fù)核閾值設(shè)定。

16. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有接觸過核酸的耗材需浸泡于10%次氯酸鈉溶液30分鐘，高壓滅菌處理后丟棄。工作臺(tái)面需用RNAase去污劑擦拭，紫外線照射30分鐘。

17. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋應(yīng)選擇低吸附離心管，采用"渦旋-瞬時(shí)離心"的混勻方式。梯度稀釋時(shí)每次更換移液器吸頭，避免產(chǎn)生氣溶膠。

18. 建立實(shí)驗(yàn)記錄追溯體系，包括試劑批號(hào)、儀器運(yùn)行參數(shù)、環(huán)境溫濕度、操作人員等信息。建議對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行雙人復(fù)核簽字。

19. 定期進(jìn)行室間質(zhì)評(píng)，每季度至少參與一次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。當(dāng)Ct值偏差＞1.5時(shí)，需啟動(dòng)儀器維護(hù)程序。

20. 建立異常結(jié)果處理流程：異常應(yīng)重復(fù)檢測(cè)，二次異常需更換試劑批次復(fù)檢，三次異常啟動(dòng)偏差調(diào)查程序并形成書面報(bào)告。