細胞克隆形成試驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是單個細胞在體外持續(xù)增殖6代以上時細胞數(shù)量已達60個左右，此細胞群體成為克隆或集落，大小在0．3～1．0mm之間。通過計數(shù)克隆形成率，可對單個細胞的增殖潛力做定量分析，了解細胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應(yīng)性?？寺⌒纬陕矢哒咂洫毩⑸婺芰?，例如永生性細胞或癌細胞克隆形成率高，正常細胞則很低。常用的方法有平板克隆形成試驗和軟瓊脂克隆形成試驗。

一、材料

1．待測的培養(yǎng)細胞。

2．細胞培養(yǎng)液．0．25％，PBS溶液，Giemsa染色液。

3．培養(yǎng)皿．吸管，培養(yǎng)板。

4．CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡。

二、方法

1．制備細胞懸液低密度細胞懸液一般根據(jù)需要配成]0~100個／ml。取生長良好的對數(shù)生單層培養(yǎng)細胞，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用0．25％消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10％牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。

2．接種和培養(yǎng)用吸管輕輕吹打細胞懸液，使之混懸均勻后，將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募毎芏?根據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻。置37℃ 5％CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。

3．觀察當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心洗2次。加純甲醇或1：3醋酸／甲醇5ml，固定15min。然后棄掉固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10~30min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

三、結(jié)果分析

1.計算各皿克隆數(shù)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)。

2．計算克隆形成率計算公式為：

克隆形成率=克隆數(shù)／接種細胞數(shù)×100%

四、注意事項

1．克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，為減少實驗誤差，細胞懸液中細胞應(yīng)分散充分，單個細胞比率至少在90％以上。此外，接種密度不能過大。

2．培養(yǎng)期問應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適當(dāng)更換培養(yǎng)液。

3．平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。

4．由于細胞生物學(xué)性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱．腫瘤細胞強。